Abstract
Lo scopo di quest’articolo è quello di analizzare lo stato di fatto della terapia genica nelle malattie dell’occhio. I risultati maggiori sono su animali ed in vitro e qualche esperimento è già in corso sull’uomo, specialmente nel mondo asiatico.
Il settore che, per ora, ha investito una applicabilità anche in Europa è soprattutto quello dei vettori virali per malattie genetiche del nervo ottico, tipo otticopatia di Leber. In generale, le applicazioni sono più significative nel segmento anteriore per la facilità di accesso, ma estremamente interessanti anche per il segmento posteriore.
Metodi
Lo studio si è proposto di valutare le più significative ed attuali prospettive in tema di terapia genica, sostanzialmente valutabili in modo attendibile dal 2018 al 2023. Quando possibile, vengono riportate valutazioni su uomo.
Introduzione
Molto si può fare negli occhi per gli errori genetici. Grande importanza rivestono i vettori virali, in particolare l’editing CRISPR-Cas9, sia per il segmento anteriore che per quello posteriore. Nonostante alcune terapie geniche siano state approvate per uso umano, i maggiori risultati, in questo campo, appartengono a modelli ottenuti sul segmento anteriore, effettuati su animali o in vitro.
Gli studi più importanti provengono dalla Cina. In Europa, risultati positivi sono stati riscontrati per la AON Aganirsen topica per neo-vascolarizzazioni corneali, unico studio che ha completato la fase 3 del trial clinico. Attualmente, in Cina, è in corso un trial per l’uso del crisp gene-editing therapy, per trattare la cheratite virale, ma lo studio è appena iniziato e si stanno reclutando pazienti. In ogni caso, anche se pochi, questi sviluppi ci forniscono grandi speranze per la traslazione della terapia genica, nel segmento anteriore nel prossimo futuro e nel segmento posteriore in un futuro più lontano (1).
Segmento anteriore
La review contiene informazioni per la terapia genica della cornea, della congiuntiva, del trabecolato e delle ghiandole lacrimali.
Fibrosi e cicatrici corneali, distrofie, cheratite erpetica, occhio secco, glaucoma e malattie diverse della superficie corneale hanno mostrato sensibilità alla terapia genica, attraverso il sistema dei vettori virali e non virali, così come le tecniche di editing, soprattutto del crsipr-cas9 e dei trattamenti epigenetici, includendo l’antisens e l siRNA terapeutici. (1)
La terapia genetica delle distrofie corneali è molto promettente. L’attuale terapia con trapianto corneale richiede spesso procedure chirurgiche complesse, appropriate cornee donatrici, frequenti rigetti così che si sono sviluppati numerosi studi che coinvolgono gene supplementation, gene silencing e gene editing. Inoltre, nuove strategie genetiche ex vivo hanno aiutato la sopravvivenza dei trapianti corneali e la prevenzione della cheratite stromale erpetica, della neo-vascolarizzazione, delle cicatrizzazioni devastanti. Il sistema crisp-cas9 offre un’ampia gamma di ingegneria genetica che rende più sicuro l’approccio chirurgico.
Esistono 22/23 distrofie corneali per lo più monogeniche con ereditarietà AD ad alta penetranza. Nella Categoria 1, i geni sono identificati e le mutazioni note. Nella Categoria 4, la clinica e la genetica non è chiara.
Nella Cornea, abbiamo Tessuto avascolare trasparente e banche dedicate alla conservazione. Negativamente incidono il flusso lacrimale, l’ammiccamento e le junction, che danno forte resistenza contro il rilascio di geni esterni. In vitro, Il tessuto corneale da trapiantare è coltivato in laboratorio con iniezione di un vettore virale o non virale ricombinante, che trasporta il gene ma problemi immunitari.
In vivo, invece, si esegue un’iniezione intrastromale diretta, iniezione intracamerale o sottocongiuntivale, collirio con più o meno aiuto della elettroporazione o degli ultrasuoni o laser ad eccimeri per aumentare la consegna del gene. Somministrazione di geni reporter in vivo nella cheratite da herpes in vivo (10% dei trapianti di cornea) beneficia della somministrazione locale di IL10, transgene somministrato con elettroporazione o a base di adeno e lentivirali o di AAV per l’HLAG (antigene leucocitario umano G) che impedisce la neovascolarizzazione, i linfociti T e i miofibroblasti.
La somministrazione retrovirale mediata dalla ciclina mutante dominante negativa G1 impedisce la foschia della cornea dopo PTK. Trasferire nei geni del fibroblasto la decorina inibisce la formazione di miofibroblasto e quindi foschia corneale e nella mucopolisaccaridosi.
Il CRISPR/Cas guidato dal RNA è universale, il cui componente fondamentale è la proteina CAS9, somministrata all’interno delle cellule bersaglio. Il CRISPR meccanico basato sul gRNA cancella i geni che creano linee cellulari knok out. CRISPR Homology End- Joing funge da modello di riferimento per la riparazione del DNA, utile nella epidermolisi bollosa distrofico recessiva, distrofie corneali. Consente correzioni genetiche utilizzando una linea guida RNA che viene trascritta inversa a RT.
Il CRISPR come terapia molecolare agisce come un farmaco vivente contro la cellula cancerosa. Nelle distrofie corneali reticolari o granulari si ripara il gene HDR. Le correzioni del gene CRISPR nella cornea sono possibili sia in ex vivo che in vivo visto che la maggior parte delle alterazioni genetiche sono a base singola. In ogni caso esistono diverse limitazioni associate alla gestione del trattamento corneale basato sul CRISPR-cas9.
L’infiammazione è un processo di malattie molto severo soprattutto nella cornea per la relativa possibile neo-vascolarizzazione e gli attuali trattamenti hanno un’efficacia limitata, effetti secondari e corta durata d’azione. La terapia genica ha mostrato un grande potenziale per queste superfici ma gli studi sono appena cominciati e decisamente sperimentali ad oggi. (2)
Nonostante ci siano risultati incoraggianti attualmente lo sviluppo dei trial sembra ancora molto lento. Vettori virali e non virali usati nel sistema delivery di acidi nucleici maggiori sembrano un buon approccio per la regolazione delle citochine pro e antinfiammatorie e della neovascolarizzzazione. La cornea ha un privilegio immunitario (3) e può essere mantenuta in coltura d’organo ex vivo (4).
Questo è molto interessante per il mantenimento delle cellule endoteliali nella banca delle cornee. Le infezioni corneali beneficiano di GFP, β-galattosidasi come geni e la terapia genica ha dimostrato un controllo migliore delle altre terapie. Gli acidi nucleici plasmidici sono stati usati come collirio sottostromale e come iniezione sottocongiuntivale. Inoltre, essa può essere aiutata dall’elettroporazione, dalla iontoforesi, dai sistemi non virali, dalle nanoparticelle magnetiche, dalle nanoparticelle polimeriche, dai vettori non virali e mediata da fattori infiammatori, come l’HAV-1, IL-10 after HSV.
La terapia genica può essere guidata anche dalla linfogenesi infiammatoria attraverso modulazione di citochine anti e pro-infiammazione. I livelli degli studi sono tutti ancora preclinici in modelli animali, scarsi in modelli umani. (5)
La caratterizzazione delle basi genetiche del glaucoma potrà identificare nuovi target per la terapia genica. Tale terapia può rilasciare proteine terapeutiche a lungo termine per il trattamento del glaucoma in grado di abbassare la pressione intraoculare e neo-protezione in modelli animali glaucomatosi. I miglioramenti dell’ingegneria genetica hanno sviluppato vettori che possono abilitare la consegna genetica a tessuti specifici come il trabecolato con effetti minimi sul tessuto circostante.
Gli studi del futuro cercano appunto l’ottimizzazione del vettore per aumentare l’efficienza trasduttiva, la biocompatibilità, la specificità tessutale e la migliore caratterizzazione della base genetica del glaucoma aiutare a identificare i nuovi target per La terapia genetica. (5) La terapia genetica può riposizionare o mutare un gene o inattivando un gene aberrante.
Segmento posteriore retina
Tutti i disordini retinici con perdita visiva sono in aumento nel mondo mostrando un deficit terapeutico importante nel segmento posteriore dell’occhio. In Francia, guidati dall’italiano Marco Bassetto, l’RNA interference(RNAi) anche se il suo trasporto nello starto retinico interno appare estremamente impegnativo. Per tale motivo gli autori hanno sviluppato un metodo chiamato MNPs- ovvero un metodo basato sul trasferimento di nanoparticelle magnetiche in grado di trasportare l’SiRNA in tutti gli strati retinici delle retine dei ratti adulti. (8)
Il metodo di questi studiosi detto “Reverse Magnetofaction” consente la trazione dell’SiRNA al MNPs. Tale metodo è una strategia nuova e non tossica sia molecolare basata su RNAi sia come nella terapia genica della retina ma ipoteticamente può essere trasferita a tutti gli organi. (8)
La retina diventa il più facile trapianto sperimentale con fattibilità di incrocio tra nanoparticelle ed RNA trasferibile. Una novità indiscussa è la possibilità che le iniezioni intravitreali vengano sostituite da un collirio microemulsionato con nanostrutture. Questa ricerca, brevettata dalla SIFI SpA e svolta a Catania a guida di Emanuela Santonocito, permette ad una micro emulsione nanostrutturata ( NaMESys) di trasportare 0.3% ( NaMESys-SOR).
Esso è citocompatibile in vitro sulle cellule corneali dei conigli e ben tollerato fino a 3 mesi di follow-up è risultato capace di rivascolarizzare occlusioni ischemiche retiniche nei ratti e di inibire l’espressione di (TNFalpha 20.7%). Responsabile della necrosi e di indurre la sintesi ossido nitrico (INos 87.3%) mRNAs comparato ai controlli.
Quindi capace di inibire le neovascolarizzazione e le proliferazioni angioretiniche diventando utile anche per le retinopatie diabetiche, nelle neovascolarizzazioni coroideali e in definitiva di tutte le malattie retiniche neovascolari. (9)
In conclusione, il NaMESys-SOR ha dimostrato di essere bene tollerato e di distribuire molto sorafenib alla retina riducendo i mediatori pro-infiammazione e pro-angiogenesi. Parlando di malattie retiniche genetiche, campo difficilissimo, tipo la x-linked retinoschisi, la coroideremia, la malattia di Stargardt, la retinite pigmentosa x-linked potrebbero essere trattate con intravitreali di AAV8 (NCT02317887) e AAV2 (NCT02416622) attualmente in fase 1 /2 clinical trials. (12)
In ogni caso tali prodotti possono essere somministrati con un approccio sotto retinico. Non conosciamo ancora le eventuali immunogenicità che possono provocare infiammazioni intraoculari.
Sono in evoluzione altre terapie geniche emergenti che includono RNAi (RNA interference) oppure terapia con antisense-oligonucleotide. L’amaurosi congenita di leber ha avuto il suo maggiore successo di terapia genica nel tipo 2 LCA, autosomico recessiva, che si rileva in 1:80000 nascite associata alla mutazione dei geni GUCY2D, CEP290 e RPE65 che sono coinvolte nella produzione di 11-cis-retinal during phototrasduction. Voretigene neparvovec-rzyl (Luxturna, Spark Therapeutics, Philadelphia) è un AAV2 che rilascia RPE65 tramite iniezione subretinica che dimostra sicurezza e beneficio nella fase 3 del trial, approvato dalla FDA nel 2017.
Gli ultimi studi hanno mostrato che gli aumenti della funzionalità visiva e del campo visivo persistono per 3 – 4 anni dopo la terapia senza nessuna risposta immune, ma purtroppo 18 occhi di 10 pazienti recentemente hanno mostrato un’atrofia corioretinica perifoveale cinque mesi dopo il trattamento che si è mantenuto per un anno dopo il follow-up producendo uno scotoma centrale.
I miglioramenti più significativi sono nei bambini che aumentano ben due linee di acuità visiva.
C’è la possibilità però di un aumento della IOP e di un’infiammazione persistente, di opacità vitreali che però possono essere gestite. Nel marzo 2020 è stata eseguita l’applicazione in vivo umana usando un CRISPR-cas system commenced to avaluete AGN-151587(EDIT-101, allergan, NCT03872479) somministrato per via sub retinica in 18 pazienti. Tale studio si concluderà nel 2024 promuovendo una manipolazione genetica in vivo con il sistema CRISPR-Cas per eliminare l malattie genetiche retiniche. Pur essendo uno studio di pochi numeri è il primo nel suo genere su umani. (12)
Retina liquida
Diversi gruppi italiani di ricercatori come il gruppo del Center for Synaptic Neuroscience and Technology dell’istituto italiano di Teconologia (IIT) di Genova diretto dal prof. Fabio Benfenati presso l’IRCCS Ospedale Policlinico San Martino di Genova e del Center for Nano Science and technology dell’ IIT di Milano, diretto dal prof. Guglielmo Lanzani, in collaborazione con la clinica Oculistica dell’IRCCS Ospedale Sacro Cuore Don Calabria di Negrar, diretta dalla dott.ssa Grazia Pertile ha dimostrato l’efficacia del modello di retina artificiale liquida presentato nel 2020 (13) anche negli stadi più avanzati della retinite pigmentosa.
Le nanoparticelle fotovoltaiche dette “nano sparks” sono efficaci anche in stadi irreversibili della degenerazione retiniche, completamente prive di fotorecettori e destrutturata da circuiti retinici residui, finora trattati con la protesi retinica (microchip).
Si è dimostrato infatti che il nano sparks made in italy riattivano la corteccia visiva occipitale, riacquisendo acuità visiva e memoria visiva. Il tutto significherebbe che questa retina artificiale di seconda generazione, biocompatibile ed ad alta risoluzione possa essere la soluzione vincente.
Cinque milioni di persone aspettano nel mondo il 2025/2026, quando saranno eseguiti i primi test sugli umani
Coroide
L’uveite posteriore non infettiva autoimmune è basata su costanti mutazioni genetiche producendo NIV, fibrosi, s. di Blau (11). Altre uveiti sono idiopatiche e non emerge nulla nell’intero esoma. Non ci sono tipi di uveite del segmento posteriore sovrarappresentati.
La soglia di significatività è stata raggiunta da 23 geni ed ogni paziente può avere più varianti di ogni gene. Livelli elevati di IL- 1β si sono riscontrati nell’uveite vitrea. I ricercatori hanno scoperto varianti non conosciute nelle corioretiniti soprattutto bilaterali ed adolescenziali.
Sono possibili previsioni di patogenicità basate sulla struttura delle varianti capN5. Curioso che ragazzi con uveite dominante (Blau) possono avere genitori sani. Ma è sempre presente un’altra forma autoimmune di uveite nell’artrite idiopatica giovanile.
È curioso che la POHS, con controverso legame all’infezione da H. capsulatum, può dare mutazioni nel m. di Crohn e nella granulomatosi orofacciale.
La struttura delle varianti dell’inflammosoma NLR può dare una previsione di patogenicità esempio. (coroiditi multifocali, uveite post lacerazione retinica ect.); la variante NLR p3 è la più importante di tutte.
Il gene tyk2 non dà uveite ma le sue mutazioni la danno (uveite simpatica, panuveite, corioretinite a colpo d’uccello, retinopatia autoimmune, uveite idiopatica, sclerite posteriore).
Notiamo che:
- il WES è un prezioso strumento diagnostico ma costoso e può dare falsi negativi;
- NOD2, NLP!, NLRP3 e NLP4 sono varianti fondamentali dell’inflammasomain grado di alterare proteine di struttura. Se abbiamo un elevato livello di NOD2 è possibile avere: S. Blau, M Crohn e Artrite psorisiaca. Se il livello è più basso possiamo avere uveite da peptidoglicano;
- l’aumento NLRP1 favorisce glaucoma acuto, M. Crohn, AR, vitiligine, la sua riduzione NLRP1 riduce anche la gravità del glaucoma acuto;
- se aumenta NLRP3 aumento la frequenza di glaucoma acuto, retinopatia diabetica, degenerazione maculare senile, cheratoendotelite fugax ereditaria e di sindrome di Behçet.
Nervo ottico
Rimuovendo un gene che indirettamente è responsabile della patofisiologia della malattia. Come abbiamo detto, si usano vettori sia virali (adenovirus, HSV, AAV, lenti virali) sia non virali. Ognuno di loro ha vantaggi e svantaggi. Studi recenti sul trabecolato usando lenti virali e vettori AAV hanno rallentato l’estrinsicazione epigenetica nel tessuto del glaucoma.
Il limite di tutto ciò è la risposta immunitaria (per ora nei ratti). I vettori adenovirali aumentano il deflusso dell’acqueo nell’organo umano e delle scimmie. Importante anche l’utilizzo di siRNAs che inibisce il gene miociclina. Infatti, Il corpo ciliare e le cellule epiteliali possono alterare la configurazione del trabecolato. L’MMP iniettato in AC dei ratti ha un effetto trasduttivo sul corpo ciliare.
Iniettando dei vettori lenti virali in AC si ha un’espressione dell’enzima ciclossigenasi-2 e delle prostaglandine F e si ottiene una buona riduzione della IOP (nei gatti per ora). I vettori AAV ricombinati hanno mostrato una riduzione dell’apoptosi delle cellule ganglionari e delle cellule di Muller (nei polli per ora). L’inibizione dell’apoptosi proteica inibisce la cascata finale delle caspasi inducendo una netta neuroprotezione (nei ratti per ora). Le iniezioni IVT di BDNF adenovirale (nei ratti) produce un’espressione selettiva delle cellule di Muller che è nettamente protettiva ma purtroppo soggetta ad immunosoppressione.
In definitiva la terapia genica può aumentare i geni mutanti conosciuti. (6)
Una buona nuova per il futuro del nervo ottico è la terapia con caspase-3 small interfering RNA-nanoparticles (neuroprotettiva dopo un danno del nervo ottico). Infatti, essa riduce l’apoptosi delle cellule neuronali. Una nuova terapia genica non virale blocca l’espressione del gene caspase-3 usando un piccolo RA (siRNA) rilasciato dalle nanoparticelle di polibutilcianoacrilato (CaspNPs) quando viene iniettato intraocularmente. CaspNPs abbassa l’immunofluorescenza retinica della capsase-3 del 57.9% nei ratti con nervi ottici schiacciati.
Le immagini con focali hanno mostrato una perdita di cellule in questi occhi del 36.1% contro il 63.4% degli occhi di controllo. Quindi la riduzione della proteina caspase-3 riduce del 50% la morte cellulare dei neuroni post-mitotici con ripristino della funzione visiva centrale (terapia non virale). In definitiva la neuro protezione o anche il ripristino della visione centrale danneggiata dopo disordini neurologici anche di diversa natura potrebbero essere ottenuti con la terapia genetica non virale con siRNA (nanoparticella).
Tutti gli studi fin qui utilizzati sono stati approvati dalla commissione etica degli esperimenti sugli animali di ogni nazione (7). Si aprono prospettive anche per le atrofie ottiche.
Conclusione
In conclusione, molto si può fare nell’occhio per gli errori genetici. Grande importanza all’editing CRISPR CAS9 in cui possiamo usare i vettori virali. I minori effetti collaterali sono i vettori AAV ma hanno limiti di trasporto (5kb di DNA).
Per i geni più grandi possono essere aggrediti con una ricombinazione intermolecolare con un vettore diverso (Usher, Stargardt). L’efficienza transgenica sul tessuto bersaglio è valutabile come risposta clinica diretta (Leber).
Punti critici:
- sicurezza dei promotori.
- effetti collaterali a lungo termine.
- costi.
- trattabilità di malattie sicuramente accecanti.
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