Cos’è il West Nile virus?
Il virus West Nile (WNV) è un arbovirus appartenente alla famiglia dei flavivirus. Il WNV è stato isolato per la prima volta dal sangue di una donna affetta da sindrome acuta febbrile in Uganda nel 1937. Questo virus si diffonde mediante un ciclo enzootico, diffuso in ampie zone del globo, che coinvolge diverse specie di uccelli e di zanzare vettore. Il virione ha simmetria icosaedrica e un diametro di circa 50 nm, provvisto di envelope, al cui interno si trova il nucleocapside in cui è racchiuso il genoma.
WNV è un virus a RNA il cui genoma è costituito da una molecola a singolo filamento a polarità positiva, costituito da circa 11.000 paia di basi. Nel dettaglio, nel genoma di WNV sono state identificate una regione 5' non tradotta (UTR), seguita da una singola lunga open reading frame (ORF) e da un'altra UTR all'estremo 3'. La singola ORF codifica una poliproteina che viene processata in 3 proteine strutturali (C, prM ed E) e 7 non strutturali (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4B e NS5). Queste proteine non strutturali sono coinvolte nella replicazione del virus, nell'assemblaggio del virione e nei meccanismi di evasione alla risposta immune dell'ospite, mentre i 3 polipeptidi strutturali compongono il virione maturo particolare le proteine mature M ed E sono responsabili di molte proprietà biologiche del virus, come la specificità di ospite, il tropismo tissutale, la capacità di replicazione e la induzione di risposta da parte delle cellula B e T.
Dal punto di vista dell'analisi filogenetica, WNV viene distinto in due differenti linee principali (I e II). La linea filogenetica I comprende ceppi che sono più frequentemente causa di infezione sintomatica in cavallo e uomo e risulta distribuita in tutto il mondo (Nord America, Europa, Africa, Asia e Australia). Gli isolati appartenenti alla linea filogenetica I sono stati ulteriormente suddivisi in 4 sottogruppi: Kunjin, Indiano, A e B. I ceppi di WNV appartenenti alla linea II sono maggiormente diffusi nell'Africa sub-sahariana e in Madagascar. I ceppi isolati di recente in Europa centrale, e in Russia sono stati preliminarmente classificati come una nuova linea filogenetica di WNV, ma il loro status tassonomico resta da definire con maggiore accuratezza. La deriva genetica è un fenomeno piuttosto infrequente in WNV, come recentemente dimostrato fra i ceppi isolati nel corso dell'epidemia che si è diffusa dal 1999 negli USA.
Come reagisce l’organismo all’infezione?
Gli anticorpi sono un importante mezzo di controllo della disseminazione del virus, in particolare al sistema nervoso centrale: le immunoglobuline di classe IgM giocano un ruolo importante in questo ambito patogenetico e sono determinabili da 2 ad 8 giorni dopo l'esordio clinico dell'infezione. La cinetica anticorpale IgM mostra un picco dopo circa 2 settimane dall'inizio dell'infezione e perdura per periodi variabili da 25 a 250 giorni.
Gli anticorpi di classe IgM non passano attraverso la barriera emato-encefalica e, conseguentemente, la loro identificazione nel liquor cefalo rachidiano è da considerare indice di produzione intratecale o di danno funzionale alla barriera stessa. La risposta anticorpale IgG segue di pochi giorni quella IgM, risulta generalmente evidente 12 giorni dopo l'esordio clinico dell'infezione e persiste per svariati anni. La risposta immune anticorpale è efficace nel controllo della fase acuta di infezione e conferisce immunità protettiva a lungo termine.
Anche la risposta immune cellulo-mediata gioca un ruolo consistente nella risoluzione dell'infezione: in particolare i linfociti CD8+ sono molto efficaci nell'eliminazione del virus. Le proteine non strutturali dei flavi virus sono in grado di sopprimere la risposta immune antivirale dell'ospite e anche nel caso dell'infezione da WNV questo meccanismo è stato ipotizzato e in parte dimostrato. In particolare, il signalling mediato da interferone A e la traslocazione nucleare di STAT-2 sono inibiti dall'espressione delle proteine NS2A, NS2B, NS3, NS4A e NS4B della variante attenuata di WNV denominata Kunjin, in modo simile a quanto dimostrato per l'espressione di NS4B di dengue virus-2.
Quali sono i sintomi?
La maggior parte delle infezioni umane da WNV sono totalmente asintomatiche. Solo in una percentuale stimabile circa 15-20% si ha la comparsa di un quadro clinico sintomatico. Il periodo di incubazione pre-sintomatico è variabile da 2 a 14 giorni. La maggior parte dei pazienti sintomatici presenta un quadro clinico molto sfumato simil-influenzale con:
- cefalea;
- mialgia;
- astenia;
- linfoadenopatia;
- vomito;
- diarrea;
- rash cutaneo
- febbre.
- meningite;
- encefalite;
- paralisi flaccida acuta.
Nei casi in cui l'infezione da WNV coinvolge anche il parenchima cerebrale si ha la comparsa della sindrome encefalitica, caratterizzata da alterato livello di coscienza, disorientamento spazio-temporale e segni neurologici focali (disartria, convulsioni, tremore, atassia, e movimenti parkinsoniani). Questi segni clinici corrispondono alla selettività dell'invasione di diverse sottopopolazioni cerebrali da parte di WNV.
La maggior parte dei pazienti affetti da febbre WN guariscono completamente in un tempo variabile da alcuni giorni a pochi mesi: la prognosi risulta comunque peggiore per i pazienti affetti da encefalite rispetto a quella dei pazienti con meningite. In un numero limitato di casi, l'infezione da WNV si manifesta come paralisi flaccida acuta, in assenza di segni meningo-encefalitici.
Questa forma è provocata dalla lesione selettiva dei corni spinali anteriori causata da WNV e i caratteri clinici principali sono costituiti da paralisi acuta asimmetrica in assenza di disturbi del sensorio. Nella fase più avanzata di questa forma di infezione si può sviluppare atrofia muscolare associata a diminuzione dei riflessi tendinei profondi, in particolare nelle forme più severe. I dati prognostici sono poco definiti: si stima che il completo recupero della funzione deambulatoria possa avvenire in circa un 30% dei soggetti colpiti a distanza di 12 mesi.
Epidemiologia e vettori del West Nile virus
La epidemiologia di WNV dipende dalla diffusione di un ciclo enzootico che ha luogo in natura fra zanzare di specie ornitofila, principalmente quelle del genere Culex, e gli uccelli.
Si stima che le specie di uccelli coinvolte con differenti livelli di efficienza in questo ciclo naturale siano circa 250, mentre solo 50 sarebbero le specie di zanzara vettore. Da queste considerazioni deriva che WNV è un virus ecologicamente generalista, al contrario di altri arbovirus appartenenti alla medesima famiglia dei flavivirus la cui diffusione dipende da un sistema ecologico che comprende un numero molto limitato di specie ospite e vettore. L’intensità della trasmissione all'uomo e agli equini, ospiti terminali non infettivi e incidentali per WNV, si ha quando il ciclo enzootico diviene epidemico in seguito all'aumento del numero di zanzare infette e a diversi determinanti ecologici locali che aumentano l'esposizione dei soggetti umani ai vettori artropodi.
Gli uccelli coinvolti nel ciclo biologico di WNV appartengono a diverse specie: corvidi (corvi, gazze e ghiandaie), passeri e fringuelli hanno dimostrato un'elevata capacità di fungere da reservoir per la trasmissione di WNV agli artropodi vettori. Sulla base di questi dati, è stato ipotizzato che la grande capacità di diffusione geografica del virus, come avvenuto negli ultimi 10 anni in nord America, sia legata ai movimenti e alle migrazioni delle specie aviarie.
Molti mammiferi, inclusi equini e uomo, non sviluppano, in corso di infezione, titoli viremici abbastanza elevati da poter fungere da vettore e sono quindi considerati ospiti definitivi non infettanti di WNV. Visto il ruolo fondamentale del vettore artropode nell’epidemiologia di WNV, la trasmissione presenta caratteri di stagionalità legati appunto all'attività delle zanzare: nelle aree a clima temperato europee, inclusa la parte settentrionale del nostro Paese, tale stagionalità inizia ai primi di maggio per terminare a metà novembre.
Ovviamente, la stagione di potenziale diffusione di WNV si allunga secondo un gradiente di latitudine da nord a sud, evidente in modo particolare in Italia a causa della conformazione geografica del territorio. Nel mese di settembre 2008, sono stati identificati un consistente numero di cavalli sintomatici con sindrome da sospetta infezione da WNV in svariati allevamenti equini delle province di Ferrara, Bologna, Rovigo e Padova. La diagnosi di laboratorio ha poi confermato il sospetto diagnostico in un'elevata percentuale di animali, fra cui un certo numero in fase viremica.
Studi per la prevenzione
Alla fine di Novembre 2008, nel territorio della bassa valle padana erano stati identificati, da parte del Centro Studi Malattie Esotiche (CESME) dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Abruzzo e del Molise di Teramo, 121 focolai di infezione in equini, con un totale di 403 animali sieropositivi, inclusi 24 viremici. Sulla base di queste evidenze epidemiologiche, nel territorio della regione Emilia-Romagna è stato attivato, a partire dagli inizi di settembre 2008, un sistema di sorveglianza dei casi umani di meningo-encefalite a liquor limpido, a cura del Laboratorio del Centro Regionale di Riferimento per le Emergenze Microbiologiche (CRREM) dell'Azienda Ospedaliera Universitaria S. Orsola-Malpighi di Bologna.
In seguito a quest'attività di sorveglianza sono stati, ad oggi, identificati i primi tre casi umani di malattia neuro invasiva (meningo-encefalite) sostenuta da WNV, di cui uno con presenza di RNA virale nel liquor cefalo rachidiano, in Italia. Una seconda branca del sistema di sorveglianza regionale dell'infezione umana da WNV prevede la valutazione della presenza di anticorpi specifici negli addetti agli allevamenti equini interessati dall'epidemia: ad oggi sono stati sorvegliati più di 100 addetti, con un tasso di sieropositività pari a circa il 5%.
I dati epidemiologici attualmente disponibili nel nostro Paese sono limitati alla bassa valle del Po: sul resto del territorio nazionale sono comunque presenti areali in cui le condizioni climatiche, ambientali ed ecologiche sono del tutto simili a quelle della zona in cui la diffusione di WNV è stata dimostrata. Questi dati suggeriscono la necessità di estendere a tutte le zone in cui le condizioni geografiche e ambientali possano essere tali da consentire il diffondersi di WNV un sistema di sorveglianza epidemiologica umana che completi quello già in atto sul territorio nazionale per l'ambito veterinario.
Questo sistema di sorveglianza si basa su indagini di laboratorio eseguite in modo regolare su vettori, uccelli (inclusi i cosiddetti polli sentinella) ed equini. A causa del notevole impatto che la diffusione di WNV ha sulla salute umana e animale, resta critico lo sviluppo di metodologie efficaci per il controllo dei vettori e per ridurre le potenzialità di esposizione dell'uomo ai vettori stessi. L'assenza di una terapia specifica efficace per il trattamento dell'infezione da WNV, ha fatto sì che negli ultimi dieci molti studi siano stati dedicati allo sviluppo di un vaccino preventivo. A partire dal 2000, sono state messe a punto diverse formulazioni vaccinali, di cui alcune sono oggi in avanzato stadio di sperimentazione clinica. Nell'ambito veterinario, in molti Paesi, escluso l'Italia al momento, sono disponibili due tipi di vaccino anti WNV: il primo consiste in una preparazione di WNV inattivato con formalina, mentre il secondo è un vaccino vivo ricombinante basato sull'impiego di Canarypoxvirus come vettore. Per l'impiego umano sono attualmente allo studio vaccini ricombinanti chimerici basati su subunità della proteina E.
Come si ottiene una diagnosi?
La diagnosi di laboratorio di infezione da WNV si basa esclusivamente su metodi che sono in grado di identificare in modo specifico il virus o la risposta anticorpale indotta dall'infezione. I dati biochimici di solito non sono utili al fine di distinguere l'infezione da WNV da altre patologie ad eziologia virale. L'identificazione del virus può essere ottenuta mediante isolamento colturale in cellule o in topo neonato, cui segue l'identificazione di solito eseguita mediante tecnica di immunofluorescenza (IFA) con anticorpi monoclinali virus specifici.
In alternativa alla tecnica di IFA si può eseguire un saggio in reverse transcription PCR (RT-PCR) per identificare il genoma virale nel monostrato cellulare o nell'animale infettato sperimentalmente con siero, plasma, tessuti o liquor cefalo rachidiano da paziente con sospetto clinico di infezione da WNV. In ogni modo, il virus viene raramente isolato da sangue di pazienti con patologia neuro-invasiva da WNV. La messa in evidenza di una risposta anticorpale specifica di classe IgM nel siero e/o nel liquor cefalo rachidiano fornisce quindi la maggiore evidenza di laboratorio a supporto della diagnosi clinica in corso di fase acuta di patologia neuro invasiva da WNV.
Nella maggior parte dei soggetti la determinabilità delle IgM nel siero e nel liquor corrisponde alla fase di comparsa dei sintomi neurologici. L'identificazione della risposta di classe IgG riveste un'utilità soprattutto epidemiologica. I metodi sierologici disponibili in routine per la determinazione della risposta anticorpale specifica anti WNV sono l'immunoenzimatica (EIA), nelle varianti per la determinazione delle IgG, delle IgM con tecnica "a cattura" e "epitope blocking"), e l'immunofluorescenza: queste due tecniche sono sostanzialmente sovrapponibili per quanto riguarda sensibilità e specificità.
Come noto nel caso di diagnosi sierologica di altre virosi da flavivirus, esiste un notevole livello di reattività sierologica crociata fra le differenti eziologie. Metodi maggiormente specifici (anche se molto più complessi e indaginosi e quindi di solito riservati ai laboratori di riferimento) sono il "Plaque - Reduction Neutralization test" (PRNT90), che viene solitamente eseguito in parallelo per una serie di altri flavivirus in grado di generare reazioni sierologiche crociate con WNV, e l'emoagglutinazione indiretta (HAI).
Un aumento =4 diluizioni di anticorpi neutralizzanti (messo in evidenza con tecnica PRNT) in due prelievi sierici ottenuti a 2-3 settimane di distanza uno rispetto all'altro viene considerato il criterio di conferma diagnostica per infezione da WNV. La determinazione della fase viremica è possibile durante una finestra temporale che inizia in fase pre-sintomatica e si chiude circa 4 giorni dopo la comparsa di sintomi. Le tecniche attraverso cui è determinabile la viremia WNV, viste le difficoltà sopra riportate per l'esecuzione delle metodiche di isolamento colturale, sono sostanzialmente quelle basate sull'amplificazione degli acidi nucleici (NAAT). La tecnica RT-PCR è un metodo rapido e affidabile per l'identificazione virale su un gran numero di campioni biologici, inclusi sangue, liquor cefalo rachidiano, tessuti umani e animali. Se sviluppata con tecnologia basata su sonde TaqMan, questa tecnica ha una sensibilità analitica pari a 0,1 PFU di RNA virale per campione.
West Nile Virus e donazioni di sangue
L'utilizzo di metodi RT-PCR con rivelazione mediante SYBR Green ha sensibilità paragonabile a quella dei metodi basati su TaqMan, ma specificità leggermente inferiore. Vista l'elevata percentuale di casi asintomatici (>80%) l'infezione da WNV pone in modo consistente la problematica della sicurezza delle donazioni di sangue, organi e tessuti.
A questo fine esistono due metodi commerciali disponibili: il TaqScreen West Nile Virus Test (Roche Molecular Systems) e il Procleix West Nile Virus Assay (Gen-Probe/Chiron Corporation). Entrambi i metodi sono dotati di elevatissima sensibilità analitica e di possibilità di esecuzione in automazione completa e sono quindi estremamente adatti all'impiego per screening trasfusionale o per la validazione virologica di donazioni di organi e tessuti.
L'applicazione di questi sistemi diagnostici allo screening trasfusionale e trapiantologico permette una sostanziale riduzione del rischio connesso alla fase viremica asintomatica dell'infezione da WNV, ma la potenziale trasmissione di WNV con sangue e organi resta un'eventualità concreta, seppur rara, poiché i livelli viremici in assenza di sintomi sono molto bassi e verosimilmente, in alcuni casi, al di sotto della soglia di sensibilità di queste metodiche, specie se le stesse tecniche vengono eseguite su campioni in pool. A questo proposito, va ricordato che la diminuzione di sensibilità dei metodi NAAT per l'identificazione di WNV decresce in modo direttamente proporzionale al numero di campioni che vengono riuniti in pool prima del saggio.
Bibliografia
- Rossini G, Cavrini F, Pierro A, Macini P, Finarelli AC, Po C, et al. First human case of West Nile virus neuroinvasive infection in Italy, September 2008 - case report. Euro Surveill. 2008;13
- Macini P, Squintani G, Finarelli AC, Angelini P, Martini E, Tamba M, et al. Detection of West Nile virus infection in horses, Italy, September 2008. Euro Surveill. 2008;13
- Savini G, Monaco F, Calistri P, Lelli R. Phylogenetic analysis of West Nile virus isolated in Italy in 2008. Euro Surveill. 2008;
- Nanni Costa A, Grossi P, Porta E, Venettoni S, Fehily D. Measures taken to reduce the risk of West Nile virus transmission by transplantation in Italy. Euro Surveill. 2008;13(42)
- Brown R, Crowcroft N, Morgan D, Eglin R. Transfusion associated West Nile virus infection: implications for Europe. Euro Surveill. 2003;7(34)
- Gubler DJ. The continuing spread of West Nile virus in the Western Hemisphere. Clin. Infect. Dis., 2007; 45:1039-1046.
- Hayes EB, Sejvar JJ, Zaki SR, Lanciotti RS, Bode AV, Campbell GL. Virology, pathology and clinical manifestation of West Nile disease. Emerg. Infect. Dis., 2005; 11: 1174-1179.
- Hayes EB and Gubler DJ. West Nile Virus: epidemiology and clinical features of an emerging epidemic in the United States. Ann. Rev. Med., 2006; 57: 181-194.
- Kramer LD, Li J and Shi PY. West Nile virus. Lancet Neurol., 2007; 6: 171-181.
- Kramer LD, Styer LM, Ebel GD. A global perspective on the epidemiology of West Nile virus. Ann. Rev. Entomol., 2008; 55: 61-81.
- Dauphin G, Zientara S. West Nile virus: recent trends in diagnosis and vaccine development. Vaccine, 2007; 25: 5563-5576.
