Cos'è la sepsi?

Cos’è la sepsi?

La sepsi è una grave sindrome clinica che trova origine nell'alterata regolazione dei meccanismi di difesa verso le infezioni e che può evolvere rapidamente verso la disfunzione multipla di svariati organi e conseguentemente verso la prognosi infausta. 

Le categorie di pazienti a rischio di sviluppare una sepsi sono molteplici: fra queste, i soggetti affetti da cancro sono sicuramente tra quelli più a rischio per gravi infezioni e per il conseguente insorgere di sepsi. Fra i fattori predisponenti maggiormente rilevanti allo sviluppo di sepsi nei pazienti neoplastici si devono ricordare la chemioterapia, la terapia immunosoppressiva antitumorale e la neutropenia indotta in seguito al trapianto di cellule staminali midollari. Oltre a ciò, nei pazienti neoplastici vengono spesso posizionati cateteri vascolari permanenti ed eseguite procedure invasive a scopo terapeutico o diagnostico che, considerate globalmente, rappresentano ulteriori fattori che favoriscono l'insorgenza di sepsi. 

Come si diagnostica?

Pertanto, le infezioni del circolo e l'eventuale conseguente sepsi restano importanti fattori prognostici negativi nei pazienti neoplastici. Attualmente, il metodo diagnostico di riferimento per le sepsi è l'emocoltura e, visti i tempi necessari per giungere alla identificazione del patogeno mediante questa indagine, spesso viene attuata una terapia antibiotica empirica ad ampio spettro. Questa opzione di trattamento ha diversi svantaggi, tra cui:

• aumentato rischio di effetti collaterali avversi; 
• insorgenza di resistenza ai farmaci antibatterici;
• generale incremento della mortalità;
• aumento dei costi di gestione dei pazienti. 

Quali sono i sintomi della sepsi?

I segni e sintomi clinici di sepsi si manifestano spesso in assenza di positività all'emocoltura, che ha dimostrato livelli di sensibilità analitica variabili tra l’8% e l’88% e tali valori di sensibilità risentono, ovviamente, anche della pregressa somministrazione di terapia antibatterica specifica o di particolari esigenze nutrizionali dei germi. Il tempo necessario per giungere all'identificazione dell'emissione del referto di negatività viene stabilito dagli standard CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute, 2007) in 7 giorni. 

Un fattore che rende a volte difficile l'interpretazione clinica del dato ottenuto mediante emocoltura, è la possibilità che i germi isolati appartengano alla normale flora saprofitica cutanea, come nel caso d'isolamento di stafilococchi coagulasi negativi (CoNS). Questi germi sono stati recentemente identificati come agenti eziologici emergenti in caso di batteriemia correlata alla presenza di catetere vascolare, evento molto frequente nel caso di paziente neutropenico affetto da neoplasia. 

Sulla base di queste considerazioni, la diagnosi microbiologica di infezione del torrente ematico nei pazienti immunosoppressi affetti da neoplasia pone una serie di problematiche a tutt'oggi ancora solo parzialmente risolte e la necessità di nuovi metodi microbiologici che possano trovare applicazione in quest'ambito è senz'altro consistente. Nello studio, di cui sono riportati di seguito alcuni dei risultati, condotto in collaborazione con i colleghi dell'ematologia e dell'oncoematologia pediatrica del Policlinico S. Orsola-Malpighi di Bologna, è stata valutata, comparativamente rispetto all'emocoltura, la performance diagnostica del test SeptiFast Test MGRADE (Roche) nella diagnosi di infezione del circolo in pazienti neutropenici affetti da neoplasia. 

Materiali e metodi

La popolazione studiata in questo studio era composta da 50 pazienti affetti da neoplasie maligne, ricoverati presso i reparti di ematologia e oncoematologia pediatrica del Policlinico S. Orsola di Bologna da cui sono stati ottenuti 85 campioni di sangue periferico in corso di episodio iperpiretico (temperatura ascellare > 38,5°C) con neutropenia (conta neutrofili < 500/ml). 

In tutti i casi, la risoluzione dell'episodio febbrile per almeno 48 ore ha significato la conclusione dell'episodio stesso e alcuni pazienti hanno avuto più di un singolo episodio febbrile. Tutti i prelievi di sangue sono stati processati presso la sezione di microbiologia del DMCSS - Policlinico S. Orsola-Malpighi di Bologna. La popolazione studiata era composta da 42 soggetti adulti (28 maschi e 14 femmine) e 4 femmine d'età compresa fra 1 e 14 anni (media 10.2). Tutti i pazienti erano affetti da neoplasie.

Il metodo di diagnosi microbiologica standard dell'emocoltura è stato eseguito secondo le indicazioni del CLSI (2007) con strumentazione automatica BactAlert (BioMerieux, Marcy l'étoile, Francia) e l’identificazione/determinazione della sensibilità antibatterica dei germi isolati è stata eseguita secondo le normali procedure manuali o automatizzate (Vitek 2, BioMerieux; ARIS trek, Sensititre) in uso nel laboratorio. 

Il SeptiFast Test MGRADE viene eseguito sulla piattaforma LightCycler. Questo metodo è basato sulla tecnologia Multiplex Real-Time PCR ed è in grado di identificare DNA di batteri e funghi rilevanti agenti eziologici di sepsi in campioni di sangue trattati con K-EDTA. Il test si esegue secondo tre passaggi analitici principali (secondo quanto contenuto in dettaglio nelle istruzioni fornite dal produttore del metodo):

• preparazione del campione mediante lisi meccanica e purificazione del DNA dal sangue intero; 
• reazioni (3 separate per batteri gram positivi, gram negativi e miceti) di amplificazione con tecnologia real-time e successiva identificazione degli ampliconi eventualmente presenti mediante sonde specifiche; 
• analisi dei risultati con software dedicato. 

In particolare, il software analitico (SeptiFast Identification Software - SIS) consente, grazie ad una valutazione combinata dei TMs, dei picchi e delle aree relative alle curve di melting, di stabilire che la presenza di DNA di stafilococchi coagulasi-negativi (cons) o di streptococchi sia da considerare come una contaminazione del campione e che il risultato non si debba considerare dal punto di vista clinico. Il test è inoltre dotato di un sistema di controllo di qualità interno i cui risultati sono valutati dal SIS come presupposto per il rilascio di risultati validi. 

Tutto il flusso di lavoro per l'esecuzione del test è stato eseguito in ambiente "DNA-free" (in ambiente BSL3) con l'impiego di reagenti e materiale disposable MGRADE fornito dal produttore. La sensibilità analitica del metodo LightCycler® SeptiFast test MGRADE è dichiarata da Roche e viene brevemente riportata di seguito. La sensibilità minima è di 30 UFC/ml di sangue trattato con K-EDTA per tutte le specie con la sola eccezione di Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes e Candida glabrata, per le quali il valore minimo di sensibilità è di 100 UFC/ml. 

Lo spettro dei microrganismi identificabili con questo test copre circa il 90% delle eziologie di sepsi identificate nel laboratorio di microbiologia del Policlinico S. Orsola negli ultimi 36 mesi e corrisponde alle eziologie maggiormente frequenti indicate dai dati di letteratura. Al fine di stabilire un parametro di confronto temporale tra l'emocoltura ed il test in RT-PCR si è definito il tempo di positivizzazione come l'intervallo (espresso in giorni) trascorso fra il prelievo venoso e il rilascio finale del risultato analitico. In caso il patogeno responsabile fosse identificato entro lo stesso giorno lavorativo tale intervallo temporale è stato arbitrariamente fissato a 0.5 giorni. 

L'analisi statistica dei dati ottenuti è stata eseguita con il software R (R development core team, 2006) e la significatività dei tempi di positivizzazione è stata valutata con lo Student t-test. L'analisi statistica è stata altresì condotta separatamente sugli episodi febbrili ed i campioni di sangue, che vista la distribuzione non gaussiana dei dati sperimentali, sono stati analizzati con la versione non parametrica del test di Pearson. 

Risultati 

Sono risultati positivi 85 campioni di sangue ottenuti da 50 pazienti con sospetto clinico di sepsi, raccolti durante un totale di 65 differenti episodi febbrili. 22 campioni, corrispondenti a 20 episodi febbrili, sono stati identificati come positivi mediante emocoltura: in 18 casi su 20 campioni, i batteri isolati dall'emocoltura erano patogeni comunemente associati a sepsi (CoNS e Staphylococcus aureus). 14 campioni su 22 risultati positivi all'emocoltura sono stati identificati in 3 casi (corrispondenti a 3 episodi febbrili singoli) il patogeno identificato era S. Aureus. In tutti questi casi il tempo di positivizzazione era statisticamente ridotto per il test in PCR rispetto all'emocoltura (p<<0.01). In altri 56 campioni (corrispondenti a 40 episodi febbrili) i due metodi usati erano concordanti in senso negativo, pur mantenendo un vantaggio temporale per il test molecolare (p<<0.01). In 8 casi di sepsi identificati come positivi mediante emocoltura, il test SeptiFast ha dato esito negativo: in 3 di questi 8 episodi, il metodo RT-PCR ha permesso di identificare la presenza di CoNS come contaminanti, suggerendo un risultato clinicamente falso positivo per l'emocoltura. 

Questi dati di laboratorio hanno trovato conferma sul versante clinico grazie al fatto che la terapia empirica cui i pazienti erano sottoposti, iniziata sulla base delle linee guida internazionali per le febbri di origine sconosciuta, che non includeva antibiotici attivi verso i CoNS, si è dimostrata in grado di risolvere completamente l'episodio di iperpiressia in 2-3 giorni.

In 3 degli 8 episodi febbrili discordanti, SeptiFast ha dato risultati negativi, mentre l'emocoltura è risultata positiva per CoNS. In uno di questi casi, è stato identificato S. Aureus in due campioni prelevati contestualmente da un catetere venoso centrale ed il paziente è stato trattato con teicoplanina ottenendo una completa risoluzione dei sintomi entro 36 ore dall'instaurazione del trattamento antibiotico. Vista la efficacia del farmaco impiegato, sia verso S. Aureus sia nei confronti di CoNS, l’eziologia di questo episodio febbrile resta non accertata con sicurezza. 

Nel secondo caso di episodio con risultati discordanti fra emocoltura e PCR, basandosi sulle condizioni cliniche gravi del paziente e sulla positività all'emocoltura, il paziente è stato trattato con una terapia combinata a base di piperacillina/tazobactam e teicoplanina che ha risolto l'episodio febbrile in 3 giorni. Di conseguenza questo caso è stato considerato come un fallimento diagnostico del SeptiFast. Nel terzo caso di un risultato positivo all'emocoltura non confermato in PCR è stata eseguita sul paziente una radiografia del torace, nello stesso giorno del prelievo ematico, che ha dimostrato un quadro radiologico suggestivo per infezione fungina.Visto che il paziente non ha ricevuto terapia specifica per CoNS, in questo caso è stato assunto che il risultato positivo dell'emocoltura sia stato generato da una contaminazione che non è stata determinata dalla PCR.

SeptiFast ha inoltre identificato 7 campioni positivi che sono risultati negativi all'emocoltura. In 3 di questi (corrispondenti a 3 diversi episodi febbrili) sono stati identificati batteri Gram negativi in assenza di positività microbiologica in altri siti di prelievo o di segni di positività radiologica suggestivi per altre infezioni. Poiché i risultati della PCR erano disponibili nelle prime 24 ore dal prelievo, tutti questi pazienti sono stati trattati con terapia antibiotica specifica ottenendo la risoluzione dell'episodio febbrile dopo un tempo medio di 3.5 giorni. 

La risoluzione clinica di questi episodi indica con forza che i risultati ottenuti con l'impiego di SeptiFast devono essere considerati rilevanti dal punto di vista clinico. Fra i restanti campioni che hanno dato risultato negativo all'indagine colturale, SeptiFast ha permesso di identificare in 3 casi S. Aureus e CoNS in un campione. Questi prelievi sono stati ottenuti in corso di follow up di pazienti che erano stati precedentemente identificati come positivi per S. Aureus o CoNS mediante emocoltura o PCR. Questi risultati trovano chiaramente spiegazione nel fatto che il metodo molecolare è in grado di identificare la sequenza di DNA target anche in assenza di microrganismi vitali e che la persistenza del DNA dei microrganismi verosimilmente è abbastanza prolungata nel sangue periferico dei pazienti, anche in seguito alla scomparsa dei sintomi clinici ed alla risoluzione microbiologica dell'infezione. 

L'analisi statistica dei risultati ottenuti ha dimostrato una sostanziale differenza dei due test studiati per la capacità di identificare qualunque tipologia di germe agente eziologico di sepsi. (Kendall-tau=0.4817445, p<<0.01). L'analisi statistica condotta raggruppando i campioni ematici secondo gli episodi febbrili, i risultati hanno dimostrato che le due metodiche avevano performance cliniche differenti (Kendall-tau=0.445702, p<0.001). Di conseguenza, il test Real-Time PCR e l'emocoltura hanno dato risultati clinicamente differenti che hanno pertanto alla dimostrazione che i due metodi non sono intercambiabili fra di loro per la diagnosi microbiologica di sepsi. 

Discussione

Negli ultimi 20 anni, la gestione clinica della sepsi ha fatto enormi passi in avanti verso il miglioramento della prognosi grazie ad un sostanziale miglioramento delle capacità di trattamento antibiotico specifico, fermo restando che la diagnosi microbiologica si basa ancora essenzialmente sui risultati delle emocolture. 

Questo quadro clinico prognostico si colloca nel trend epidemiologico d'aumento che la sepsi ha dimostrato in pari periodo. I tentativi di aumentare la sensibilità dell'emocoltura sono stati numerosi nello stesso periodo e si sono soprattutto focalizzati sulla riduzione del tempo necessario per la positivizzazione e il rilascio del risultato definitivo: tutti questi studi e proposte di modifica metodologica si sono rivelati sostanzialmente inefficaci, lasciando invariato il valore di sensibilità del metodo nel paziente oncoematologico, sono svariati i fattori che rendono l'emocoltura un test microbiologico incompletamente soddisfacente: l'elevata incidenza di infezioni fungine e di infezioni catetere correlate cause da CoNS, il ritardo, o anche la completa impossibilità a determinare l'eziologia della sepsi porta, come principale conseguenza, a un trattamento antibiotico inadeguato in una percentuale di casi stimata attorno al 25% del totale con un sostanziale incremento del rischio di mortalità. 

A questo proposito si deve ricordare come esistano svariati e molteplici studi che dimostrano come un trattamento antibatterico inadeguato costituisca un importante fattore di mortalità e di aumento di rischio per effetti collaterali avversi (incluso un aumento delle resistenze antibiotiche del germe responsabile). Tutti questi fattori contribuiscono in modo sostanziale all'aumento dei costi di gestione del paziente affetto da sepsi in ambiente ospedaliero.

La possibilità di applicare le metodologie molecolari basate sull'amplificazione enzimatica termostabile degli acidi nucleici alla diagnosi di sepsi, come alternativa ai classici metodi colturali, è stata già valutata in passato. Una delle più consistenti limitazioni di questo approccio diagnostico consisteva nella difficoltà di potere ottenere simultaneamente in tempi brevi risultati che potessero coprire l'ampio spettro di patogeni potenzialmente coinvolti nell'eziologia della sepsi, a causa della difficoltà caso di applicazione pratica di una tecnologia in grado di identificare simultaneamente circa il 90% dello spettro dei potenziali agenti eziologici di sepsi in una popolazione di pazienti neoplastici neutropenici con sospetto clinico di sepsi. 

Fra i principali vantaggi dell'impiego di SeptiFast in questa popolazione deve essere sicuramente ricordato quello del vantaggio temporale per ottenere un’identificazione eziologica del patogeno responsabile. Va da sé che il solo dato molecolare non potrà essere da solo sufficiente vista la necessità di conoscere i dati di antimicrobico sensibilità dei singoli isolati batterici o fungini: resta però il fatto che la conoscenza aggiornata delle mappe epidemiologiche di resistenza dei singoli reparti ospedalieri consente una precisa e pronta terapia (che potremmo definire SeptiFast-guidata) che in questo studio si è dimostrata ampiamente ed efficacemente capace di risolvere buona parte degli episodi febbrile dei pazienti studiati, ben prima della disponibilità del dato eziologico ottenuto con emocoltura. 

Un altro consistente vantaggio che l'applicazione del test SeptiFast porta alla diagnosi eziologia di sepsi, consiste nella capacità del metodo di identificare le contaminazioni da batteri "irrilevanti" presenti nel campione e dovute principalmente ad errori od imprecisioni nell'esecuzione del prelievo stesso. Per la natura stessa dell'emocoltura, questo non è possibile se la diagnosi si esegue con metodo colturale. Il tasso di emocolture positive per la presenza di questa tipologia di microrganismi (principalmente CoNS) arriva anche a un terzo del totale dei risultati positivi in un ospedale che esegua un notevole numero di emocolture ogni anno. Tale alto numero di risultati "clinicamente irrilevanti" genera un aumento del costo totale di gestione della diagnosi di sepsi che si potrebbe evitare utilizzando in modo contestuale il test SeptiFast. 

Il metodo molecolare ha anche dimostrato di avere una maggiore sensibilità e specificità clinica, rispetto all'emocoltura, per l'identificazione dei germi Gram negativi. Il limite più consistente dell'impiego del metodo PCR nella diagnosi di sepsi, come sopra accennato, risiede nell'impossibilità di ottenere il dato relativo alla sensibilità antimicrobica del germe. Sulla base di questa consapevolezza è totalmente irragionevole pensare che il test SeptiFast possa sostituirsi ed uso contemporaneo delle due metodiche che sono complementari. L'utilizzo simultaneo di questi due metodi diagnostici consente, infatti, i massimi valori di rapidità, sensibilità e specificità clinica nella diagnosi microbiologica di sepsi. 

In conclusione, il test SeptiFast ha dimostrato di essere un metodo rapido ed altamente sensibile per la diagnosi di sepsi nel paziente neoplastico immunocompromesso, che solo in un limitato numero di casi ha dimostrato discordanza rispetto al risultato ottenuto con l'emocoltura, a tutt'oggi percepita come il gold standard in questo ambito diagnostico. 

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